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刊期:月刊
国内定价:每期12元 ,全年144元
创刊时间:2004年
国内统一刊号:CN15-1333/R
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实验研究
 
中华鲟软骨活性成分体外抑制血管生成作用的实验研究 2011/10/9
   

中华鲟软骨活性成分体外抑制血管生成作用的实验研究
吕宝军1   谢小铭1   谭  敏2*
(1.中山大学附属第五医院普通外科2区  珠海  519000;2.中山大学附属第一医院微创外科  广州  510080)
摘要:目的:探讨中华鲟软骨活性成分体外抑制血管生成的作用。方法:应用丙酮沉淀和超滤法抽提和分离中华鲟软骨活性成分,通过鸡胚绒毛尿囊膜实验分析中华鲟软骨抑制血管生成的作用。结果:中华鲟软骨溶液a组平均主血管数为(21.52±3.64),相对于生理盐水平均主血管数(33.84±3.14)差异显著(t=4.922,P<0.05);b组平均主血管数为(28.41±2.13),与生理盐水组对照差异不显著(t=2.032,P>0.05);c组平均主血管数为(7.16±1.31),相对于生理盐水平均主血管数有统计学差异(t=2.473,P<0.05)。结论:中华鲟软骨活性成分对体外的血管生成有明显的抑制作用。
关键词:中华鲟软骨  血管生成  抑制作用
中图分类号:R285.5                  文献标识码:B                 文章编号:1672-8351(2011)08-0043-02

软骨成分的抑瘤作用早在80年代就已经得到了人们的重视。根据美国哈佛大学霍文博士有关“肿瘤生长需要首先建立新生血管网络”的理论[1],能否抑制血管的形成和生长是防瘤、抑瘤的关键。起初人们只是发现软骨本身并不长血管。自80年代开始,美国、古巴、澳大利亚、墨西哥、以色列等各国科学家,均深入研究了鲨鱼软骨的临床应用,并取得了令人瞩目的成就[2]。本实验从中华鲟软骨分离得到中华鲟软骨活性制剂,通过体外实验对其抗肿瘤效应进行了初步的研究,同时也为我国生物医药的发展及宝贵资源的发掘开辟了一条新路。
1 材料与方法
1.1原料与试剂
中华鲟(顺德市创世纪农业园馈赠)、盐酸胍(Sigma公司)、丙酮(广州化学试剂厂)、牛血清白蛋白(BSA)(Sigma公司)、考马斯亮蓝G-250染料(Sigma公司)、Millipore超滤器(5,000和100,000)(美国Amicon公司生产)、721分光光度仪、低温高速离心机(美国HEPMI公司生产)、组织粉碎机(宁波新芝科研究所生产)。
1.2中华鲟软骨有效成分的抽提、分离和浓度的测定
剖取200g中华鲟软骨,将中华鲟软骨用组织粉碎机粉碎至匀浆,经400ml1M盐酸胍抽提48h,45~65%丙酮的分级沉淀,5,000分子量和100,000分子量的Millipore超滤器等步骤超滤得到中华鲟软骨溶液a(全成份)、中华鲟软骨溶液b(≥100,000分子量)、中华鲟软骨溶液c(5,000~100,000)三种溶液,通过Bradford法测定中华鲟软骨溶液蛋白质的浓度。
1.3体外抑制血管生成作用的实验研究(付生法[3])
滤纸放入打孔器中制作直径1mm的滤纸片,高温高压消毒备用,将40只受精鸡蛋表面酒精消毒后放入37.80C孵化箱,鸡蛋气室向上,蛋托与鸡蛋长轴约呈70~800,每天早晚各小心转动一次,孵化至第7天时,在照卵灯下寻找胚头,约在胚头右下方0.5~1.0cm处划定约0.5cm×1.5cm的开窗位置, 在蛋壳开窗位置用微型挫切开窗,用无菌手术刀切破壳膜,暴露出绒毛尿囊膜,将已经消毒的滤纸小片放入中华鲟软骨溶液a、中华鲟软骨溶液b、中华鲟软骨溶液c中浸湿后,部分放入生理盐水中,分别选取10只鸡胚,依次用小镊子夹取a、b、c溶液以及生理盐水中的滤纸片放入绒毛尿囊膜血管较少的部位作为a组、b组、c组、生理盐水组,所有鸡胚用灭菌透明胶带封窗后放入孵化箱,孵化2天后揭除透明胶带取膜制作标本,将制作的标本摄像血管计数,以给药点为中心,以半径间隔5mm将鸡胚绒毛尿囊膜划分为3个区域,计数各区域的主血管数的总和。
1.4统计学处理
使用SPSS 12.0统计软件进行数据分析,计量资料采用t检验,P<0.05差异有统计学意义。
2 结  果
2.1超滤所获得的中华鲟软骨粗溶液a、b、c的浓度分别是12.389mg/ml、34.048mg/ml、0.221mg/ml,见表1。
2.2中华鲟软骨活性成分抑制血管生成的体外实验研究
目前,公认的血管生长抑制模型有两种,即兔角膜诱生新生血管抑制模型和鸡胚绒毛尿囊膜血管生长抑制模型。我们应用后一种模型来检测软骨蛋白的活性,结果表明,生理盐水组血管生长良好,血管分支适中,中华鲟软骨溶液a、b、c与生理盐水对照相比,软骨对血管生成有明显的抑制作用,血管分支减少,尤其以溶液c抑制效果较显著,结果如表2所示。计数各处理组及各区域的主血管数,a组平均主血管数为(21.52±3.64),相对于生理盐水平均主血管数(33.84±3.14)差异显著(t=2.473,P<0.05);b组平均主血管数为(28.41±2.13),与生理盐水组对照差异不显著(t=2.032,P>0.05);c组平均主血管数为(7.16±1.31),相对于生理盐水平均主血管数有统计学差异(t=4.922,P<0.05)。
表1  中华鲟软骨溶液OD值与浓度的关系表

表2 三组中华鲟软骨溶液抑制血管生成的各区域的主血管数(x±s,条)

3  讨  论
血管生成(angiogenesis)是指在已形成的血管的基础上形成新血管的过程,它是肿瘤持续生长和发生转移的必要前提。无论是原发性肿瘤还是继发性转移瘤在生长扩散过程中都依赖血管生成,肿瘤新生毛细血管生成是肿瘤转移过程中的一个关键步骤[4]。
血管生成过程受到机体严格的、多层次的控制。在正常情况下,宿主能够控制血管生成,而且机体可在短时间内打开或关闭这些控制系统,但是肿瘤组织中缺乏控制血管生成的调节机制,肿瘤血管生成机制涉及到血管生成因子与血管生成抑制因子之间的调节失衡,生长因子浓度上升或者抑制因子浓度下降均可导致肿瘤的血管生成[5]。基于以上事实,目前研究应用血管生成抑制剂以达到阻断肿瘤转移已成为一个重要热点。
本实验通过鸡胚绒毛尿囊膜实验检测中华鲟软骨抑制血管生成的作用。目前,公认的血管生长抑制模型有两种,即兔角膜诱生新生血管抑制模型和鸡胚绒毛尿囊膜血管生长抑制模型,我们用后一种模型来在体外检测软骨蛋白的活性。用三种软骨溶液分别处理7日龄的鸡胚绒毛尿囊膜,2日后,计数各区域的主血管数总和,比较三种溶液与生理盐水对照组之间的差异。以溶液a和溶液c可以抑制鸡胚绒毛尿囊膜血管的生成,尤其以溶液c的结果明显,说明中华鲟软骨可以在体外抑制血管的生成,含有血管生成抑制的因子。
本文对中华鲟软骨活性物质的研究仅刚刚开始,还有待于深入研究其活性物质的成分和功能,本实验对促进它的临床应用研究提供了积极的理论根据,为寻找一种有效的抗肿瘤药物以及为中华鲟的开发利用开创了一条有效的途径。
参考文献
[1]Folkman J. Merler-E. et al. Isolation of a tumor factor responsible for angiogenesis[J]. J-Exp-Med, 1971, Feb 1;133(2): 275-288.
[2]Bargahi A, Rabbani-Chadegani A. Angiogenic inhibitor protein fractions derived from shark cartilage[J]. Biosci Rep, 2008, 28(1):15-21.
[3]付生法,陆应麟,张朝山等. 检测血管生长因子作用的鸡胚绒毛尿囊膜技术[J]. 军事医学科学院院刊, 1993, 17(4):294-296.
[4]Rabbani-Chadegani A, Abdossamadi S, Bargahi A, et al. Identification of low-molecular-weight protein (SCP1) from shark cartilage with anti-angiogenesis activity and sequence similarity to parvalbumin[J]. J Pharm Biomed Anal, 2008, 46(3):563-567.
[5]罗红宇, 徐佳晶, 余新威, 等. 赤魟软骨粗提物的血管生成抑制活性定量分析[J]. 海洋学研究, 2008, 26(4):61-65.

《北方药学》2011年8期

 
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