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主办单位:内蒙古自治区食品药品学会
编辑出版:北方药学编辑部
刊期:月刊
国内定价:每期12元 ,全年144元
创刊时间:2004年
国内统一刊号:CN15-1333/R
国际标准刊号:ISSN1672-8351
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实验研究
 
限制性液体复苏对失血性休克大鼠肾脏一氧化氮合酶的影响 2011/10/25
   

吕宝军  苟新敏  谢小铭(中山大学附属第五医院  珠海  519000)
摘要:目的:探讨限制性液体复苏对失血性休克大鼠肾脏一氧化氮合酶表达的影响。方法:60只SD大鼠制成未控制性重度失血性休克模型,随机分成对照组、常规组(常规大量液体复苏组)和限制组(限制性液体复苏组),检测和比较休克复苏后各组存活大鼠肾脏组织eNOS蛋白、iNOS蛋白的表达。结果:失血性休克大鼠限制组肾脏组织eNOS蛋白的表达比常规组显著升高;与对照组比较,常规组肾脏组织eNOS蛋白的表达升高;常规组肾脏组织iNOS蛋白的表达比对照组低,与常规组、对照组比较,限制组肾脏组织iNOS蛋白的表达显著降低,以上差异均有统计学意义(P均<0.05)。结论:限制性液体复苏可以显著改善失血性休克大鼠肾脏损伤中微循环的紊乱。
关键词:限制性液体复苏  失血性休克  一氧化氮合酶
中图分类号:R364.1+4              文献标识码:B             文章编号:1672-8351(2011)09-0037-03

本研究通过制备失血性休克大鼠模型,观察限制性液体复苏对失血性休克大鼠肾脏组织中内皮型NOS (eNOS)及诱导型NOS(iNOS)蛋白表达的影响。
1 对象与方法
1.1对象
健康、性成熟、清洁型标准的雄性SD大鼠70只,体重310~450g,由中山大学动物实验中心提供。兔抗大鼠iNOS单克隆抗体(Abcam公司,美国),兔抗大鼠eNOS单克隆抗体(Bioworld公司,美国),羊抗兔二抗(Santa Cruz公司,美国)。
1.2麻醉和监测
应用0.5%戊巴比妥钠30mg/kg腹腔注射,对70只大鼠分别进行麻醉,将其固定于25℃的恒温板上,置导管于颈动脉和股静脉,颈动脉导管连接压力转换器、监护仪行持续血流动力学监测和抽取血液样本,股静脉导管用于连接输液泵进行液体复苏。完成上述操作后,符合以下条件者入选本实验:①置管操作中出血量少于0.2ml(手术纱布在术前和术后的重量差1g=0.9ml);②观察10min,大鼠血流动力学状态平稳并有自主呼吸。其中有60只大鼠符合条件,成功率85.71%。
1.3动物模型的制作
参照Capone等的方法该模型分以下两期:①院前期:时间为90min,先通过颈动脉导管每5min抽取1次血液,前2次为每次1ml/100g,后2次为每次0.5ml/100g,共抽取4次。抽取的血液经肾素抗凝处理以备急救期回输,然后在30min时局部严格消毒后,在离尾巴根部1/4处切断,造成活动性出血,用预装肾素的无菌容器盛接失血以以备急救期回输。剩余的60 min用作早期液体输注,根据血压情况应用输液泵输注等渗盐水,速度为2ml·kg-1·min-1,必要时调整输液速度。②急救期:时间为60min,用作手术止血和足量的液体输注,包括输血至平均动脉压(MAP)≥80mmHg,血细胞比容(HCT)≥30%。
1.4实验分组
将60只大鼠随机分为3组,每组20只。①对照组,在院前期不接受液体输注,但在急救期接受手术止血和足量的液体输注;②限制性液体复苏组(限制组),在院前期30~90min接受等渗盐水的限制性输注,维持MAP在40mm Hg左右,并进行急救期处理;③常规大量液体复苏组(常规组),在院前期30~90min接受等渗盐水的快速大量输注以维持MAP在80mm Hg左右,并进行急救期处理。各组急救期结束1h后,采集存活大鼠的血液及组织标本。
1.5 Western blot检测各组大鼠肾脏组织中eNOS、iNOS蛋白的表达
取-70℃保存的冰冻肾脏组织100mg,加0.5ml蛋白裂解液,提取胞浆蛋白。测定蛋白浓度后。取等量样品上样,SDS-PAGE电泳,转硝酸纤维素膜,5%脱脂奶粉TBST液封闭,加一抗孵育,4℃过夜,加入辣根过氧化物酶标记的二抗,37℃孵育1h,洗膜DAB显色,凝胶成像系统扫描分析。
1.6统计学方法
实验所得数据以均数±标准差(x±s)表示,应用SPSS 11.5统计软件进行完全随机化设计资料均数的t检验,以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结  果
2.1各组大鼠失血前基本情况之间比较
各组大鼠失血前各抽取血样0.3ml行血常规检查。3组大鼠的体重、HB含量、HCT和血小板计数(PLT)等基础情况如表1所示,经单因素方差分析,各组基本情况之间比较,差异无显著性意义。
2.2肾脏组织中eNOS蛋白和iNOS蛋白的表达
常规组肾脏组织eNOS蛋白的表达高于对照组,与常规组、对照组比较,限制组肾脏组织eNOS蛋白的表达显著升高;常规组肾脏组织iNOS蛋白的表达比对照组低,与常规组、对照组比较,限制组肾脏组织iNOS蛋白的表达显著降低,差异均有统计学意义(P均<0.05),见表2。
表1  3组大鼠的基础情况比较(x±s)

P均>0.05。
表2  3组大鼠肾脏组织中eNOS蛋白和iNOS蛋白表达的比较(x±s)

t1表示常规组与对照组比较;t2表示限制组与常规组比较。
3 讨  论
休克发生、发展的机制复杂,主要与自由基损伤和微循环障碍等因素有关,随着对休克病理生理研究的不断深入,对于创伤失血性休克,特别是有活动性出血的患者,在手术彻底止血前不给予大量的液体输入,而是限制液体的输入量,只用晶体液维持机体的基本需求,在手术彻底止血后再进行大量的液体复苏,后者称作限制性液体复苏[1],可以明显降低休克的死亡率。限制性液体复苏不同于传统的复苏方式,早期复苏时通过对输液的质、量和速度进行适当的控制,使血压维持在一个较低水平的范围内,直至彻底止血[2]。
NO作为信号分子、炎症介质和免疫调节因子,具有广泛生物活性。NOS作为NO生物合成的限速酶有原生型(nNOS)、内皮型(eNOS)和诱导型(iNOS)3种。近年来,研究显示,NO参与了休克过程并发挥着保护和介导损伤的双重作用,NO对休克微循环的调节起着重要的作用,NOS在机体内有3种异构酶:iNOS、cNOS/eNOS和nNOS,目前认为NO在休克损伤中的作用取决于生成NO的NOS的类型、部位和酶的活性有关,一般认为在iNOS作用下产生的NO对肝脏有损害作用,而在eNOS作用下产生的NO对肝脏有保护作用[3]。
本实验对照组相对于限制组和常规组,失血性休克大鼠肾组织eNOS含量下降,iNOS含量上升,这是因为在肾脏缺血低氧状态下,肾组织中NO合成所必需的合成酶和氧离子不足导致。休克大鼠限制性液体复苏早期可以促进肾脏活化 eNOS,催生少量NO,减轻再灌注对微循环的损伤;晚期,iNOS 通过转录活化,合成大量的NO及NO与超氧阴离子作用生成的过氧亚硝酸盐,诱导细胞凋亡或坏死。关于NO在失血性休克微循环损伤中的双重作用或许可以用eNOS和iNOS在缺血再灌注损伤中的不同角色来解释。
本实验结果还显示,休克大鼠限制性液体复苏比常规液体复苏组肾组织iNOS含量下降,eNOS含量上升,表明了限制性液体复苏通过上调失血性休克大鼠肾脏组织中eNOS表达,从而实现其对肾脏缺血再灌注损伤的保护作用。但其发生机制以及iNOS在失血性休克中的作用不明,有待更深入地专题研究。
参考文献
[1]郑世成,陈君长,王坤正,等.创伤性休克术前限制性液体复苏对患者的影响[J].第四军医大学学报,2009,30(7):652-654.
[2]余艳红,黄莉萍,宋天蓉,等.限制性液体复苏在产科失血性休克治疗中的应用[J].中国实用妇科与产科杂志,2009,25(2): 148-150.
[3]向进见,田夫,李文岗,等.姜黄素对大鼠肾缺血再灌注早期肾组织一氧化氮表达的影响[J].世界华人消化杂志,2010,18(10):987-992.
△基金项目:珠海市科技工贸和信息化局科研项基金(项目编号:2010B040102029)

《北方药学》2011年9期

 
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